1-انتقال ژن به وسيله اسپرماتوزوئيدها:
در ابتداي پيشرفت تکنيک‌هاي ترانس ژنيک به نظر مي‌رسيد که تنها اسپرماتوزوئيدها ابزار مناسب وراثت براي
انتقال يک قطعه ژنتيکي خارجي به ژنوم حيوانات مي‌باشند. Bracket و همکارانش در سال 1971 ثابت کردند که اسپرماتورزوئيدهاي پستانداران قادرند که به DNA خارجي متصل شده و آن را در طي فرآيند باروري و لقاح به تخمک ماده‌ها منتقل کنند. عملکرد اين روش در سال 1987 نيز براي
طيور پيشنهاد شد. به طور کلي يک قطعه DNA به اسپرم باند مي شود و اين اسپر براي تلقيح ماده‌ها به کار مي‌رود و اسپرمي که تخمک را بارور مي‌کند، حاوي ژن مورد نظر است که آن را به تخمک منتقل مي کند و در نهايت آن ژن در جوجه‌هاي هچ شده بروز پيدا مي کند. اخيراً اين روش در توليد پستانداران ترانس ژنتيک به کار مي رود، اما هنوز اطلاعات قانع کننده اي از اين که
انتقال ژن با واسطه اسپرم مي تواند به طور موفقيت آميزي، ترانس ژن را به Germline منتقل کند در دسترس نيست .
(mazaziak et al, 2004).
..
2-روش ريز تزريق DNA :
در اين روش DNA را به کمک ميکروپيپت به درون هسته سلول ها مي فرستند. اين DNA احتمال ادغام با ژنوم سلول ميزبان را خواهد داشت. اين روش يک روش عمومي براي معرفي ژن‌هاي خارجي به پستانداران مي‌باشد، که اغلب
انتقال DNA به پيش هسته تخمک تازه بارور شده صورت مي‌گيرد. اما استفاده از اين تکنيک براي تزريق DNA به تخم پرندگان د مقايسه با پستانداران بسيار مشکل‌تر است. زيرا يک تخم تازه گذاشته شده مرغ شامل حدوداً 000/60 – 000/50 سلول است. بنابراين ريز تزريق DNA به طور گسترده براي تخم مرغ هاي تازه به کار نمي‌رود.
اما روي رويان تازه بارور شده مرغ بعد از کشتن و جمع آوري تخم ها انجام مي شود. تخم‌هاي ريز تزريق شده براي هچ به محيط کشت سه مرحله‌اي Exovo منتقل مي شوند
.(mazaziak et al, 2004; Love et al, 1994; Sherman, 1998)
..
3-انتقال ژن به کمک رترو ويروس‌ها:
ناقل‌هاي رتروويروس يکي از ناقل‌هاي عمومي در
انتقال ژن مي‌باشند و مي‌توانند ژن‌هاي خارجي را به germliae
طيور انتقال دهند. تکنيک هاي
انتقال ژن با استفاده از رتروويروس‌ها به کرات براي ايجاد مرغ‌هاي ترانس ژنيک به کار رفته است. زيرا تيترهاي بالاي رترويروس ها امکان
انتقال مورد نظر را به سلول هاي زيادي دارا است. به طور کلي رترورويروس ها شامل يک ژنوم از نوع RNA مي‌باشند که يک هسته پروتئيني که حاوي آنزيم Integrase مي‌باشد، قرار دارد.
پوشش پروتئيني ويروس به گيرنده هاي ويژه روي سلول ميزبان متصل مي‌شود. سپس اجزاء ويروس به وسيله ميانجيگري گيرنده ها با استفاده از اندوستيوز به داخل سيتوپلاسم ميزبان وارد مي‌شود. RNA ويروسي به CDNA که مي تواند به داخل هسته منتقل شود، کپي مي‌شود و CDNA با DNA سلول ميزبان يکپارچه مي شود (با استفاده از Integrase ).
اين DNA متصل شده به DNA ميزبان، به همراه سلول ميزبان همانندسازي انجام ميدهد و توارث آن نيز بر اساس ژنتيک مندلي صورت مي گيرد.
DNA ويروسي الحاق يافته به ژنوم ميزبان مي تواند يک RNA ويروسي براي سنتز و پروتئين‌هايي که شامل يک پليمراز (pol) و (gag) و پروتئين هاي غشايي يا بسته بندي کننده (Env) ايجاد مي‌کند. اين سه دسته پروتئين يک پوشش ويروسي جديد ايجاد مي‌کند و RNA ژنوم ويروسي را داخل آن بسته بندي کند. اين کمپلکس جديد به غشاء سلول ميزبان منتقل مي‌شود و به خارج سلول هدايت مي‌شود.
در انواع وکتورهايي که توانايي تکثير دارنده ژن‌هاي ساختماني و توالي هاي بسته بندي کننده (Packaging) سالم و کامل هستند تا توانايي ادامه توليد ذرات ويروسي را داشته باشند که مي توانند ديگر سلول‌ها را آلوده کنند. بنابراين وکتورهاي رتروويروسي که قادر به تکثير هستند به آساني قادر به آلوده‌سازي تعداد کافي از سلول‌هاي زاينده و
انتقال ژن مورد نظر به دومين و متعاقباً نسل‌هاي بعد را دارا است. اما در ايجاد
طيور ترانس ژنيك با استفاده از رتروويروس‌هايي که توانايي تکثير را دارند، قادر خواهند بود که دائماً ويورس را به محيط آزاد کنند. (در اصطلاحبه آنها shedder گفته مي شود) .اين امر وضعيت قابل قبولي نيست.
اما ناقل‌هاي رتروويروسي که توانايي تکثير ندارند (Replication – Defective – Retroviruses) ، به اين علت که ژن‌هاي pol يا gag يا env را که براي تکثير لازم است، ندارند، ذرات جديد ويروس هايي ناقص هستند و آلودگي محيطي را کاهش مي دهند. ناقل هايي که توانايي تکثير ندارند، استعداد آلوده سازي سلول هاي ميزبان را دارند، ولي توانايي ايجاد ذرات جديد ويروسي را ندارند.
رتروويروس‌هاي ناقص يعني آن هايي که توانايي تکثير ندارند، توانايي
انتقال ژن هاي خارجي با تعداد بازهاي بيش از kb10 را دارند. زيرا آن ها بعضي از ژن هاي ضروري براي همانند سازي خود را از دست داده اند. ناقل هاي رتروويروسي جديد متکامل تر شده اند و بر پايه استراتژي‌هاي جديد حداقل آلودگي را ايجاد مي‌کند. (silter, 1986,1987; Bosselman et al, Cosset, 1990; Thoraval, 1995)
..
4-انتقال مستقيم DNA به بيضه ها:
اين روش در سال 1995 توسط مارشال گزارش شد. در اين روش پتانسيل
انتقال مستقيم DNA خارجي به بافت بيضه پايين است و از عوامل محدود کننده آن به شمار مي رود.(mazaziak et al, 2004)
..
5-انتقال ژن به کمک سلول هاي بلاستومري:
سلول‌هاي بلاستومري در کارهاي ترانس ژنتيکي بسيارمفيدند، آن ها به راحتي از حيوان دهنده به حيوان
گيرنده منتقل مي شوند و به راحتي در تشکيل بافت‌هاي سوماتيک و بافت هاي جنسي يا germline شرکت مي‌کنند.
در محيط کشت چندين روز قابل نگهداري هستند و مي توان بيان ژن هاي
انتقال يافته را در آن ها قبل از
انتقال به جنين در آزمايشگاه بررسي کرد. اين ويژگي هاي آن ها باعث مي‌شود که اين سلول‌ها ناقل‌هاي ايده‌آلي براي تغييرات ژنتيکي جديد در germline باشند.
در اين تکنيک سلول ها استخراج مي شوند. دستکاري مي شوند و در نهايت در داخل يک رويان در حال رشد قرار مي گيرند. با اين هدف که يک جنين آميخته (Chimeric) ايجاد شود که در germline آن، ژن مورد نظر وجود دارد. در نهايت ايجاد نتاج G0 که اين نتاج با همديگر آميزش پيدا مي‌کنند تا مرغ‌هاي G1 را ايجاد کنند که ترانس ژن را با خود حمل مي‌نمايند .(Kamihira et al, 2004) .
..
6-انتقال ژن به کمک سلول‌هاي PGC (primordial germ cells).
از زماني که سلول‌هاي PGC به عنوان سلول‌هاي پايه در توليد اسپرماتوزوآ و يا تخمک شناخته شدند، استفاده از آن ها روش مفيدي در توليد طيوري ترانس ژنتيک مي‌باشد.
سلول‌هاي PGC (سلول‌هاي جنيني اوليه) منشأ germline در جنس
طيور هستند، اين سلول‌ها در مراحل ابتدايي تمايز جنيني (مرحله دهم) شروع به تمايز مي کنند و در يک منطقه خارج جنين که به هلال زاينده (Germ crescent) منتهي مي شود ، قابل استخراج اند.
...
اين سلول‌ها از هلال زاينده به برآمدگي گنادي در جنين (Gonadol ridge) توسط دو مکانيسم مهاجرت مي کنند و در نهايت در ساختار germline شرکت مي کنند.
..
1-به طور غير فعال در يک گردش درون – خارج جنيني
(intra – extra embryonic circulation)
2-به طور فعال با به وجود آمدن خون و جريان خون اين سلول ها را به اپيتليوم لايه ي زاينده مهاجرت مي کنند.
مقصد نهايي هرتغييري در ژنوم
طيور سلول زاينده (germline) است. به اين علت که اين سلول‌ها سرانجام ژن
انتقال يافته را به نسل‌هاي بعدي منتقل خواهند کرد.
سلول‌هاي PGC مرغ مي توانند در خارج ازبدن در يک محيط کامل از عوامل رشد، تکثير يافته و بعد از
انتقال ژن به آن ها در توليد
طيور ترانس ژنتيک استفاده شدند.
تزريق سلول هاي PGC ورتروويروس‌ها و سلول‌هاي بلاستومري به صفحه زاينده در جنس مرغ در يک تخم تازه بارور شده صورت مي‌گيرد. با اين اميد که اين سلول هاي تزريق شده در germline جنين قرار گرفته ويک مرغ ترانس ژنيک ايجاد شود که بتواند ژن را به نسل هاي بعدي منتقل کند.
به طور کلي
انتقال ژن با استفاده از رتروويروس‌ها و سلول‌هاي PGC از روش‌هاي عملي و مرسوم در
انتقال ژن به ژنوم
طيور مي‌باشد (Mazaziak et al, 2004).
مشکل ترين مرحله در ايجاد
طيور ترانس ژنيک
انتقال ژن است. موقعي که پرنده هاي G0 هچ مي‌شوند ايجاد لاين از آن ها در مقايسه با
انتقال ژن کار خيلي جزئي و ساده‌اي است.
_____________________
'گرداورنده:دکترافسانه زرگر